Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk
melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya
adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi
total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 untai DNA secara sempurna dalam 50 ml reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi
ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun demikian,
sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali
over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi variasi dalam sumber, jumlah, dan
kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform,
alkohol, EDTA, deterjen (SDS), atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat
mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil
dan DNA yang terikat gel agarosa pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug
untuk dapat terpotong sempurna.
Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh
karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20C untuk sebagian besar enzim.
Beberapa enzim perlu disimpan pada -70C. Enzim ini harus tetap disimpan di
dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang
ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim
restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau
menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada
cairan yang menempel di dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat
dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.
Faktor-Faktor yang Harus Diperhatikan dalam Pemotongan dengan Enzim Restriksi
4/
5
Oleh
Wahid Priyono,S.Pd.
