Berikut ini akan dijelaskan beberapa tipe-tipe teknik ELISA.
A. Indirect ELISA
Adapun tahapan umum yang digunakan pada teknik ini untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi
dalam serum adalah sebagai berikut:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui
konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter.
Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi.
Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva
standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu
sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting,
seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan
dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi
non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau
permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak
diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena
adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen
standar.
4. Plate dicuci,
dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan
lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang
antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan
berkonjugasi dengan enzim yang memiliki substrat spesifik. Tahap ini bisa
dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci
untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk
mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer,
spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi
terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai
molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA
adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada
sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga
konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein
serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.