Enzim ligase
DNA ligase merupakan enzim yang
mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi
dan kerusakan. Fragmen DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi dapat
disambung kembali atau disambung dengan pasangan yang lain oleh enzim DNA
ligase. Reaksi penyambungan ini membutuhkan energi, yang diberikan
melalui penambahan baik ATP atau NAD dalam reaksi tersebut.
Manfaat/Peran/Fungsi dari Enzim Ligase
DNA ligase yang paling sering digunakan
diperoleh dari E. coli yang terinfeksi bakteriofaga T4. Secara biologis, DNA
ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki
saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis,
serta berperan dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA
ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi
DNA ligase. Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi
terdegradasi dan sel
akan mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel,
maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. Enzim
restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA
di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang
menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.
Jenis-Jenis DNA Ligase
DNA ligase dapat
digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD+ atau ATP. DNA ligase NAD+-dependent ditemukan
hanya di bakteri. Sementara itu, DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea,
dan virus. Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang
berbeda, keduanya memiliki mekanisme katalitik yang sama. DNA ligase ATP-dependent
yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase.
T4 DNA
ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang
menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul,
diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan
penyangga yang mengandung ATP dengan
konsentrasi 0.25-1 mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang
luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu.
Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya
membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C. Sementara itu,
jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu
4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.
T7 DNA ligase merupakan DNA
ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa. DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai
struktur yang terdiri dari dua domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain
yang lebih besar.
Enzim Ligase: Manfaat, Serta Jenis-Jenis Enzim Ligase
4/
5
Oleh
Wahid Priyono,S.Pd.
